1. Introducción
Bacterias aerobias, gram positivas Staphylococcus aureus es el agente causante de muchas infecciones oportunistas en humanos y animales ( Kools y Bannerman, 1995). Como patógeno humano, S.aureus causa infecciones superficiales, de piel profunda y tejidos blandos, endocarditis y bacteriemia, así como una variedad de enfermedades mediadas por tóxicos, incluida la gastroenteritis , síndrome de piel escaldada estafilocócica y síndrome de shock tóxico 25 – 30% de personas sanas portan este organismo en la piel (o) en la nariz. (Fidalgo et al ., 1990 – Roberts et al., 1991).
Staphylococcus aureus produce una variedad de toxinas extracelulares y factores de virulencia que contribuyen a su potencial patogénico. Las cepas de S.aureus producen exotoxinas tirogénicas, como las enterotoxinas estafilocócicas (SES) y TSST-1 (Sharma et al. , 2000). Los SES son un grupo de proteínas monocatenarias de baja masa molecular que son similares en composición y actividad biológica y difieren en antigenicidad (Fueyo et al ., 2001). Las enterotoxinas de S.aureus pueden detectarse por su actividad biológica, por inmunoensayos y por PCR (MC Lauchlin et al., 2000) La prevalencia de aislados enterotoxigénicos clínicos S.aureus ha sido reportado en diferentes países por muchos investigadores (Mehrotra et al ., 2000; Fueyo et al ., 2001; Becker et al ., 2003).
a) Meticilina – Staphylococcus aureus resistente
Meticilina – Staphylococcus aureus resistente es un tipo de estafilococo que es resistente a ciertos antibióticos. Estos antibióticos incluyen meticilina y otros como cloxacilina, dicloxacilina, oxacilina y nafcilina, así como una clase de fármacos estrechamente relacionados conocidos como cefalosporinas. Las cepas de S.aureus resistentes a la meticilina son resistentes a la meticilina y esencialmente a todos los demás antibióticos betalactámicos
MRSA se informó por primera vez en 1961, poco después de la introducción de meticilina en humanos medicamento para tratar estafilococos resistentes a la penicilina. El MRSA se ha convertido en un importante patógeno en la medicina humana (Lee JH – 2003) MRSA es un importante patógeno asociado al hospital y a la comunidad que causa una amplia gama de enfermedades, incluyendo endocarditis, oesteomielitis, TSS, neumonía, intoxicación alimentaria y carbuncos (Oliveira DC, et al ., 2005).
En el hospital indio, MRSA es una de las causas comunes de infecciones adquiridas en el hospital y diferentes hospitales han deportado a cualquier lugar desde 30 a 80% de resistencia a la meticilina basada en pruebas de sensibilidad a antibióticos. La resistencia a la meticilina se debe a la presencia del gen A que codifica la proteína de unión a la penicilina (PBP 2A) con baja afinidad por los antibióticos beta-lactama. Este gen se transporta en el cromosoma de cassette estafilocócico Mec, un elemento genético móvil único, integrado en el estafilococo
cromosoma (Kalayama et al., 2001).
b) Coagulasa Negativa Estafilococos
Hay un Aumentar la conciencia de las capacidades de los estafilococos coagulasa negativos para causar la enfermedad. Los estafilococos coagulasa negativos se han reconocido como la causa más frecuente de prótesis valvular, endocarditis, infección de derivación neuroquirúrgica e infección de dispositivos ortopédicos protésicos (Siebert y WT et al ., 1978). En general, los estafilococos coagulasa negativos se informan como Staphylococcus epidermidis . Sin embargo, Kloos y Schleifer (15700283 han propuesto varias especies nuevas de estafilococos coagulasa negativos y grupo interogeno de organismos y varias especies nuevas. ).
Dado que muchos estafilococos son resistentes a la penicilina mediante la producción de b-lactamasa, meticilina y otras penicilinas resistentes a la b-lactamasa son agentes terapéuticos importantes para el tratamiento de la infección por estafilococos. Sin embargo, un porcentaje significativo de S.epidermidis es resistente a la meticilina (Sieberet et al., (1978) y Sabath et al ., 1969).
c) TSST – Toxina del síndrome de shock tóxico
Síndrome de shock tóxico (TSS) y su asociación con S. aureus fueron descritos por primera vez por Todd et al ., En 1978 . S. aureus las cepas para producir enfermedades en entornos clínicos y alimentarios dependen, entre otros determinantes, de su capacidad para producir toxinas extracelulares. Una serie de enterotoxinas estafilocócicas (SES) clasificadas como A, B, C1, C2, C3, D o pueden ser producidas por algunas cepas (Pimbley y Patel 1998). La mayoría de los estafilococos aureus aislados de pacientes con TSS, una enfermedad aguda grave que conduce rápidamente a la falla del sistema de múltiples órganos, producen una toxina conocida como TSST-1. Aunque se asocia clásicamente con el uso de tampones,
TSS también se ha asociado con una variedad de afecciones no relacionadas con la menstruación (Hertzer, 2001).
Staphylococcus aureus es portador del gen tst que codifica TSST-1. (Ver, RH & amp; AW Chow, 1989). El gen tst es cromosómico y la toxina está sintomáticamente relacionada con el grupo de toxinas de enterotoxina estafilocócica (Iandolo. JJ, 1989). (Blomster y Hantamaa DA et al ., 1986).
d) Detección del gen TSST-1
La producción de coagulasa, un producto del gen de coagulasa (coa), es Los criterios principales en el laboratorio clínico de microbiología para la identificación de S. aureus. La coagulasa ptn es un factor de virulencia importante para S.aureus . El gen coa tiene regiones de repetición polimórficas que pueden usarse para diferenciar aislamientos de S.aureus . La región variable del gen coa está compuesta por 81 repetición de secuencia corta en tándem bp (SSR S) (Van Belkum et al ., 1998).
Amplificación de análisis de coa y RFLP de productos amplificados para la discriminación si se han notificado previamente aislamientos de S.aureus (Goh et al ., 1992; Shopsin et al ., 2000; da silva & amp; da silva, 2006).
TSST es una enfermedad multisistémica potencialmente mortal que se presenta con fiebre, hipotensión, vómitos, diarrea, hiperemia de la mucosa y una erupción eritematosa. Esto está asociado con la infección de sitios mucosos o secuestrados por la producción de TSST cepas de S.aureus que generalmente pertenecen al bacteriófago grupo-I.
TSST tipo-1 (también conocido como enterotoxina tipo F (o) exotoxina pirogénica C) es el responsable más frecuente, a través de las enterotoxinas B (o) C también puede causar el síndrome. Las cepas TSS produjeron TSST-1, la toxina aceptada como la causa más probable de TSS (MS Bergdoll et al ., 1984). La cepa negativa de coagulasa produce TSST-1 y SEA. Dado que ha habido desacuerdo sobre la producción de TSST-1 por cepas negativas de coagulasa (Crass et al ., 1986).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
a) RECOGIDA DE MUESTRAS
A Totalmente 19 se recolectaron muestras de pus para nuestros estudios. Se recogieron muestras de pus de personas infectadas con heridas usando un hisopo de algodón estéril y muestras recogidas en el hospital del área de Namakkal. Después de la recolección de muestras, se inoculó inmediatamente en agua con peptona y la muestra se llevó al laboratorio en 2 horas.
b) AISLAMIENTO DE Staphylococcus aureus
Bucle de El cultivo de agua de peptona se rayó en la placa de agar sal Mannital. Las placas se incubaron a 37 oC para 24 – 48 hrs. La colonia aislada de los medios selectivos se utilizó para un análisis posterior.
c) IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus
I) MANCHA DE GRAMOS ( Hans Christian Gram (1853 – 1938)
Frotis bacterianos de 16 – 18 hrs culturas antiguas se hicieron en diapositivas limpias sin grasa , fijado con calor y teñido de la siguiente manera. El portaobjetos se inundó con una solución de cristal violeta durante un minuto, se drenó y se enjuagó con agua; seguido de una solución de yodo de Grams durante un minuto, se escurrió y se enjuagó con agua. Sec y luego contrarrestado con safranina durante un minuto y observado bajo un microscopio de inmersión en aceite.
ii) MOTILIDAD PRUEBA
La técnica de caída colgante fue para le permitieron observar la motilidad del organismo. La observación se realizó bajo el microscopio para el movimiento de dardos o corchos del organismo.
iii) PRUEBA DE CATALASA
Se colocó una pequeña cantidad de cultivo sobre un portaobjetos limpio. Se colocó una gota de peróxido de hidrógeno al 3% sobre el cultivo y se observó la efervescencia. La producción de efervescencia mostró la capacidad de producir la enzima catalasa.
iv) PRUEBA DE OXIDASA
El organismo detectado en el disco de oxidasa (HiMedia) observó el cambio de color azul o púrpura en 10 segundos. El color púrpura es positivo mientras que negativo se denota sin cambio de color.
(B) PRUEBA BIOQUÍMICA
I) PRUEBA INDOLADA
Se inoculó un ciclo de cultivo en agua de peptona y se incubó a 370 C para pasar la noche. Después de la incubación, 0,5 ml de Kovac se agregó el reactivo.
Reacción positiva -Anillo rojo cereza
Reacción negativa -Anillo de color amarillo
ii) PRUEBA ROJA DE METIL
La colonia del agar de nutrientes se inoculó en medio MRVP y luego se incubó a 370 C durante la noche. La prueba empleada para detectar la producción de ácido durante la fermentación. Además, se añadieron 0,5 ml de rojo de metilo.
Reacción positiva – Color rojo
Reacción negativa – Color amarillo
iii) PRUEBA DE PROSKAUER VOGES
Se inoculó un ciclo de cultivo en medio MRVP, que se incubó a 370 C durante la noche, para detectar acetil metilcarbinol del ácido pirúvico. Además del reactivo VP (0,5 ml de alfa-naftol al 5% y 0,5 ml de 40% KOH) fue agregado.
Reacción positiva – Color rojo
Reacción negativa – Sigue siendo incoloro
iv) PRUEBA DE UTILIZACIÓN DE CITRATO:
La cultura fue rayada en el Simmon & # (******************************************************************; s citrato de agar inclinado e incubado a 370 C durante la noche.
Reacción positiva – Color azul profundo de Purssian
Reacción negativa – Color verde
v) PRUEBA DE UREASE:
Un ciclo lleno de cultura se inoculó en Christenson tubo de caldo de urea. Se indicó la producción de ureasa.
Reacción positiva – Color rosado
Reacción negativa – Sin cambio de color
vi) FERMENTACIÓN DE AZÚCAR:
Se inoculó un ciclo de cultivo en diferentes azúcares en los medios de azúcar junto con Durham tubo de s y Andrade indicador de s.
Reacción positiva – Color rosado
Sin fermentación – incoloro
vii) HIERRO DE AZÚCAR TRIPLE:
Se preparó agar triple hierro de azúcar y se dispensó en tubos y se esterilizó a 1210 C para 15 minutos e inclinaciones hechas. Se inocularon tubos con organismos de prueba que apuñalaron el agar y rayaron los sesgos. Los tubos se incubaron a 370 c para 24 horas.
Resultado positivo: El color del medio cambia a amarillo, el ennegrecimiento del medio y la rotura en el medio de elevación del medio indica producción de ácido, producción de H2S y producción de gas respectivamente. C) PRUEBA DE ESTABILIDAD ANTIBACTERIANA
Se usó el método estándar de difusión de disco Kirby-Bauer para determinar los perfiles antimicrobianos de Staphylococcus aureus aísla contra la meticilina. El caldo de nutrientes se preparó y esterilizó a 121 ° C e inocularon los aislamientos y luego se incubaron a 37 ° C para 24 hrs. Después del período de incubación, el cultivo del caldo se inoculó en la superficie de las placas de agar Mueller-Hinton y se colocaron discos antibióticos y luego las placas se incubaron a 37 ° C para 18 a 20 h. La zona de inhibición y resistencia se midió, registró e interpretó de acuerdo con la recomendación de la fabricación del disco.
D) PRUEBA DE COAGULADO
El tubo se llena con 0,5 ml de 1 pulg. 10 plasma de conejo diluido. Al tubo, se añaden 0,1 ml de caldo de cultivo nocturno de bacterias de prueba. Todos los tubos se incuban a 37 ºC y observado hasta cuatro horas. El resultado positivo se indica mediante la gelificación del plasma, que permanece en su lugar incluso después de invertir el tubo.
E) AMPLIFICACIÓN DEL GEN DE SÍNDROME DE CHOQUE TÓXICO DE Staphylococcus aureus
I) AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO
- Tomó 1,5 ml de caldo de cultivo nocturno en tubos de microcentrífuga de 2 ml.
- Los tubos se centrifugaron a 8000 rpm por 5 minutos.
- Después de la centrifugación, se descartó el sobrenadante y se recogió el sedimento. El sedimento se suspendió en 200 μl de 1X TE buffer + 100 μl de 10% SDS y mezclado por vórtice.
- Los tubos se mantuvieron en baño de agua a 60 ° C para 20 minutos.
- Luego agregado con 300 μl de fenol: cloroformo: mezcla de alcohol isoamílico (24: 25: 1) para extraer el ADN y mezclar completamente por vórtice.
- Los tubos se centrifugaron a 10000 rpm para 10 minutos para separar las fases.
- La fase acuosa que contiene el ADN se eliminó cuidadosamente y se transfirió a nuevos tubos.
- Volumen igual de 100 Se añadió Isopropanol% a los tubos que contenían la fase acuosa.
- Se mezcló invirtiendo los tubos de 3 a 4 veces.
- Los tubos se centrifugaron a 10000 rpm para 10 minutos para peletizar el ADN.
- Se descartó el sobrenadante y se recogió el sedimento.
- Al gránulo, 200 μl de 70% etanol fue agregado y centrifugado a 10000 rpm para 10 minutos.
- Luego se decantó completamente el etanol y el sedimento se secó al aire para dar ADN purificado.
- Vuelva a suspender el sedimento de ADN seco en 20 μl de tampón TE y se disuelve tocando.
- Las soluciones de ADN se almacenaron a 4 ° C para su posterior trabajo.
F) CONFIRMACIÓN DE ADN POR ELECTROFORESIS DE GEL AGAROSA: La electroforesis en gel de agarosa se lleva a cabo en una unidad de electroforesis submarina horizontal. Se prepararon treinta ml de gel de agarosa al 1% con tampón TBE 1X (no mezclar) y se calentó el contenido para obtener una solución transparente para moldear gel de agarosa. Después de enfriar la solución, se añadieron 7 µl de solución de tinte de tinción al sistema de moldeo. Se permitió que el gel se solidificara, y luego se desarmó cuidadosamente del sistema de fundición sin alterar los pocillos y se colocó en un tanque de electroforesis lleno de tampón TBE 1X (el nivel del tampón debería estar por encima del gel). Se mezclaron 5 µl de ADN de muestra genómica con 2 µl de tinte de carga de gel y luego se cargaron en gel y se cargaron simultáneamente 3 µl de marcador de ADN proporcionado en el pozo cercano. Los terminales de la tarjeta de alimentación se conectaron en las posiciones respectivas, ejecute el gel en 50 V, hasta que el tinte de carga de gel migre más de la mitad del longitud de gel. Luego apagó la unidad y visualizó el ADN aislado bajo un transiluminador UV. Sacarosa 40% y azul de bromofenol (0. 25%) se mezclaron con agua estéril doblemente destilada. bromuro de etidio (10 mg) se mezcló con 10 ml de agua destilada estéril. (Es cancerígeno y debe tratarse o manejarse en consecuencia). El método de amplificación se realizó de acuerdo con Johnson & amp; Tyler (1993) con alguna modificación. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron 5-ATGGCAGCATCAGCTTGATA-3 y 5- TTTCCAATAACCACCCGTTT – 39 (Sigma, India) .De este modo se obtiene un amplicón 533 bp. Las condiciones de PCR fueron como se describió anteriormente (Johnson & amp; Tyler, 1993. La amplificación se llevó a cabo en un sistema de PCR Genei, India, utilizando el siguiente procedimiento. El 20 µl consta de 2 μl de 1 × tampón de PCR, 1 mM de cada uno de los cebadores (0.5 μl), 15 mM de cada desoxinucleótido trifosfato (1 l) y 5 U es la concentración final de Taq ADN polimerasa (0.5 μl) Plantilla 1 μl y 14 .5 μl de agua de grado molecular. Después de la desnaturalización inicial en 94 ° C durante 4 min, las muestras fueron sometidas a 30 ciclos de desnaturalización en 94 ° C durante 1 min, recocido a 55 ° C durante 1 min y extensión a 72 ° C durante 1 min. Se realizó una extensión final en 72 ° C durante 7 min. Después de la PCR, 20 μl de las mezclas de reacción se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, que contiene bromuro de etidio (0.2 mg / ml), en presencia de un marcador de peso molecular de ADN apropiado. En el presente estudio 19 se recogieron muestras de torunda para detectar la presencia de contaminación por estafilococos con resistencia a la meticilina y aislamientos negativos a la coagulasa. Entre la 19 hisopo de la herida 10 ((**************************************************************. 6%) se obtuvieron aislamientos de Staphylococcus por estándar prueba y medios selectivos. Se obtuvieron los aislamientos seleccionados de azúcar de sal de manitol que son grandes colonias circulares, convexas, lisas, brillantes, opacas y de color amarillo dorado. Las células son grampositivas, no móviles y con forma de uva en forma de cocos en racimo. La catalasa resultó positiva. En el resultado de la prueba bioquímica, MR mostró positivo. Los aislados de Staphylococcus se mantuvieron en una placa de agar con nutrientes para estudios posteriores. La distribución de aislamientos de los diferentes tipos de muestras, como 5 / 10 (50%) aislamientos de quemaduras, 3/4 (75%) por accidente, 2/5 (40%) de muestras de piel Entre los 3 tipos de muestras de mayor incidencia obtenida por accidente (75%) y ocurrencia más baja en la piel (40%) Entre la 10 muestras de S.aureus cepas 8 (80%) se obtuvieron aislados de coagulasa negativa S.aureus . Hubo una distribución de aislamientos de los diferentes tipos de muestras, como 4/5 (80%) aislamientos de quemaduras, 2/3 (66. 6%) aislamientos de accidente, 2/2 (100%) aislados de infección de la piel. Entre los 3 tipos de muestras, la mayor ocurrencia obtenida de una infección de la piel y la menor ocurrencia en un accidente. Los aislamientos negativos a la coagulasa se sometieron a un ensayo de estabilidad a meticilina mediante el método de difusión en disco de agar (método de Kirby Bauer ) Todos (8) de los aislados Staphylococcus aureus mostraron sensibilidad o resistencia al antibiótico meticilina. Fuera apagado 10 aísla 8 (80%) fue resistencia a la meticilina. Entre los 3 tipos de muestras, las resistencias más altas se observaron en las muestras de infección por quemaduras e infecciones de la piel (100%). En muestras de heridas accidentales 33. Se obtuvo el 3% de los aislamientos de resistencia. En este ensayo de PCR, todos los aislamientos de Staphylococcus aureus se sometieron de acuerdo con el estudio anterior. Entre la 10 aísla los 3 aislamientos que producen el gen TSST. La distribución de genes tóxicos a partir de aislamientos de infecciones de la piel tiene 100% y (********************************************************************. 3% por infección accidental. En las muestras quemadas, no se observó el gen TSST. Un total de 19 se recolectaron muestras para nuestro estudiar. Estas muestras fueron de tres tipos, a saber, infección de la piel, muestras de quemaduras y heridas accidentales de las cuales se aisló Staphylococcus aureus mediante el uso de medios selectivos de agar sal de manitol (MSA) y pruebas bioquímicas . Fuera de 19 muestras, 10 se obtuvieron aislamientos. Entre los 3 tipos de muestras de muestras de accidentes (75%) tuvo la mayor prevalencia de Staphylococcus aureus seguido de muestras de heridas quemadas (50%) y finalmente muestras de infección de la piel (40%). Entre la 10 aislados de El Staphylococcus aureus, 8 resultó negativo para la coagulasa mediante la prueba de coagulasa y se distribuyó como infección de la piel 100%, quemadura de la herida 80% y muestras de heridas accidentales con El menos. (66. 6%) Los 8 aislamientos de Staphylococcus aureus coagulasa negativo que fueron Los resultados obtenidos anteriormente se probaron posteriormente para determinar la resistencia a los medicamentos antibacterianos según el método de difusión en disco de Kirby – Bauer. Se descubrió que todos eran resistentes al antibiótico meticilina. En el siguiente, todos los aislamientos de Staphylococcus aureus coagulasa negativo fueron sometidos al ensayo de PCR de acuerdo con estudios previos realizados. Entre los 8 aislamientos, 3 aislamientos produjeron el gen TSST. Se encontró que la distribución del gen tóxico de los aislados de infección de la piel era 100% y el de muestras de heridas accidentales fue 33. 3% mientras que hay no había gen tóxico en las muestras de heridas quemadas. En conclusión, el TSST desarrollado en este estudio es un método conveniente y confiable para la detección de tst en estafilococos, que podría ser útil tanto para investigación como para fines clínicos. Además, TSST demostró que la distribución de tst era más frecuente en MRSA. Esta es la primera vez que la detección por PCR del gen TSST-1 en S. aureus se ha informado de Namakkal, y se necesitan más estudios sobre la aparición de TSS en la comunidad y el papel del productor de TSST-1 S. aureus en esta enfermedad en Namakkal. Resumen de Contenidos I) Tinte de carga de muestra:
ii) bromuro de etidio:
G) REACCIÓN DE CADENA DE POLIMERASA (Johnson & amp; Tyler (1993)
4.
RESULTADO a) CONFIRMACIÓN Y MANTENIMIENTO DE Staphylococcus AISLADOS .
b) PRUEBA DE COAGULASA
c) ENSAYO DE ESTABILIDAD DE METICICILINA
d) AMPLIFICACIÓN DEL GEN TSST DEL Staphylococcus aureus
5. RESUMEN Y CONCLUSIÓN